Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Etablierung eines Gewebemodells zur Untersuchung der erblichen Form des Retinoblastoms, eines häufig bereits im frühen Kindesalter auftretenden Tumors. Hierfür soll das RB1-Gen in hES-Zellen zunächst auf einem Allel mit artifiziellen oder in Patienten anzutreffenden Mutationen versehen und entsprechend stabil modifizierte hES-Zell-Klone etabliert werden. Die derartig mutierten hES-Zellen, die nach gegenwärtigem Kenntnisstand bei Vorliegen eines nicht-mutierten RB1-Gens auf dem zweiten Allel keine Defizite bei der Differenzierung zu retinalen Zellen aufweisen, sollen dann in Richtung retinaler Organoide differenziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung durch AAV-vermittelten Transfer der Komponenten des CRISPR/Cas-Systems mit einer (ggf. ebenfalls patientenspezifischen) weiteren Mutation auf dem zweiten Allel des RB1-Gens versehen werden. Die in beiden Allelen mutierten Zellen sollen dann weiter zu retinalen Organoiden differenziert und diese umfassend charakterisiert werden, beispielsweise hinsichtlich der Präsenz und Charakteristika spezifischer retinaler Zellpopulationen und der korrekten Organisation des retinalen Organoids, bezüglich der Expression retinaler Marker-Gene sowie in Hinblick auf das Transkriptom bestimmter retinaler Zellpopulationen. Ziel ist es, die Effekte verschiedener Mutationen auf die retinale Differenzierung bzw. auf die Desorganisation der sich entwickelnden retinalen Organoide sowie ein ggf. kritisches Zeitfenster für die zweite Mutation zu bestimmen. Zudem sollen jene Zelltypen zweifelsfrei identifiziert werden, die bei Vorliegen spezifischer Mutationen den Ausgangspunkt für die Tumorbildung darstellen.
Gens nunmehr in einem Organoid-Modell nachgebildet werden, um die entscheidenden Schritte
