Untersuchung von entwicklungsabhängigen Prozessen und deren anästhesiologischer Relevanz in hES-Zell abgeleiteten Hirnorganoiden
Entwicklung GABAerger und glutamaterger Neurone im Organoid-Modell
Hintergrund des Forschungsvorhabens sind Hinweise darauf, dass eine verstärkte Methylierung in bestimmten Regionen des Gens für Proopiomelanocortin (POMC) mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Adipositas einhergeht. Dies könnte durch die Eigenschaften der POMC-Region bedingt sein, die die Kriterien eines sogenannten metastabilen Epiallels erfüllt. Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen daher neuronale Zell- und Organoidmodelle etabliert werden, an denen frühe Vorgänge der Methylierung des POMC-Gens untersucht werden können. Dabei soll geklärt werden, wie variabel die Methylierung bestimmter Regionen des POMC-Gens ist und ob eine verstärkte Methylierung mit einer verminderten Expression dieses Gens (und folglich mit einer verminderten Sekretion von Melanozyten-stimulierendem Hormon, MSH) assoziiert ist. Hierfür werden geeignete hES-Zellen in den naiven Status überführt, in Richtung von Neuronen des Hypothalamus bzw. neuronaler Organoide differenziert und umfassend hinsichtlich der Methylierung des POMC-Gens und dessen Expression charakterisiert. Zudem soll zu Kontrollzwecken die Methylierung weiterer (bereits bekannter) metastabiler Epiallele untersucht werden. Im nächsten Schritt des Forschungsvorhabens soll dann bestimmt werden, ob und inwieweit die Präsenz sog. C1-Metaboloite und das Vorhandensein oder Fehlen transposabler Elemente (Alu-Elemente) die Methylierung der POMC-Gen-Region in sich entwickelnden menschlichen Neuronen beeinflusst. Dabei sollen auch Veränderungen in der Methylierung der mit der POMC-Gen-Region assoziierten Histone und deren Variabilität in Abhängigkeit von den genannten Bedingungen bestimmt werden. Zu Kontrollzwecken soll die Methylierung des POMC-Gens sowie weiterer metastabiler Epiallele auch in anderen aus hES-Zellen gewonnenen Zelltypen untersucht werden.
Im folgenden soll dieses Modell zur Analyse molekularer
Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Etablierung eines Gewebemodells zur Untersuchung der erblichen Form des Retinoblastoms, eines häufig bereits im frühen Kindesalter auftretenden Tumors. Hierfür soll das RB1-Gen in hES-Zellen zunächst auf einem Allel mit artifiziellen oder in Patienten anzutreffenden Mutationen versehen und entsprechend stabil modifizierte hES-Zell-Klone etabliert werden. Die derartig mutierten hES-Zellen, die nach gegenwärtigem Kenntnisstand bei Vorliegen eines nicht-mutierten RB1-Gens auf dem zweiten Allel keine Defizite bei der Differenzierung zu retinalen Zellen aufweisen, sollen dann in Richtung retinaler Organoide differenziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung durch AAV-vermittelten Transfer der Komponenten des CRISPR/Cas-Systems mit einer (ggf. ebenfalls patientenspezifischen) weiteren Mutation auf dem zweiten Allel des RB1-Gens versehen werden. Die in beiden Allelen mutierten Zellen sollen dann weiter zu retinalen Organoiden differenziert und diese umfassend charakterisiert werden, beispielsweise hinsichtlich der Präsenz und Charakteristika spezifischer retinaler Zellpopulationen und der korrekten Organisation des retinalen Organoids, bezüglich der Expression retinaler Marker-Gene sowie in Hinblick auf das Transkriptom bestimmter retinaler Zellpopulationen. Ziel ist es, die Effekte verschiedener Mutationen auf die retinale Differenzierung bzw. auf die Desorganisation der sich entwickelnden retinalen Organoide sowie ein ggf. kritisches Zeitfenster für die zweite Mutation zu bestimmen. Zudem sollen jene Zelltypen zweifelsfrei identifiziert werden, die bei Vorliegen spezifischer Mutationen den Ausgangspunkt für die Tumorbildung darstellen.
Inaktivierung des RB1-Gens nunmehr in einem Organoid-Modell
Untersuchung von entwicklungsabhängigen Prozessen und deren anästhesiologischer Relevanz in hES-Zell abgeleiteten Hirnorganoiden
Entwicklung GABAerger und glutamaterger Neurone im Organoid-Modell
Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Etablierung eines Gewebemodells zur Untersuchung der erblichen Form des Retinoblastoms, eines häufig bereits im frühen Kindesalter auftretenden Tumors. Hierfür soll das RB1-Gen in hES-Zellen zunächst auf einem Allel mit artifiziellen oder in Patienten anzutreffenden Mutationen versehen und entsprechend stabil modifizierte hES-Zell-Klone etabliert werden. Die derartig mutierten hES-Zellen, die nach gegenwärtigem Kenntnisstand bei Vorliegen eines nicht-mutierten RB1-Gens auf dem zweiten Allel keine Defizite bei der Differenzierung zu retinalen Zellen aufweisen, sollen dann in Richtung retinaler Organoide differenziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung durch AAV-vermittelten Transfer der Komponenten des CRISPR/Cas-Systems mit einer (ggf. ebenfalls patientenspezifischen) weiteren Mutation auf dem zweiten Allel des RB1-Gens versehen werden. Die in beiden Allelen mutierten Zellen sollen dann weiter zu retinalen Organoiden differenziert und diese umfassend charakterisiert werden, beispielsweise hinsichtlich der Präsenz und Charakteristika spezifischer retinaler Zellpopulationen und der korrekten Organisation des retinalen Organoids, bezüglich der Expression retinaler Marker-Gene sowie in Hinblick auf das Transkriptom bestimmter retinaler Zellpopulationen. Ziel ist es, die Effekte verschiedener Mutationen auf die retinale Differenzierung bzw. auf die Desorganisation der sich entwickelnden retinalen Organoide sowie ein ggf. kritisches Zeitfenster für die zweite Mutation zu bestimmen. Zudem sollen jene Zelltypen zweifelsfrei identifiziert werden, die bei Vorliegen spezifischer Mutationen den Ausgangspunkt für die Tumorbildung darstellen.
Inaktivierung des RB1-Gens nunmehr in einem Organoid-Modell
Inhalt des genehmigten Vorhabens ist die Gewinnung von Netzhaut-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen. Dazu sollen zunächst sowohl Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) als auch Zellen der neuralen Retina (Photorezeptor-Zellen) unter Nutzung dreidimensionaler Kultursysteme durch sequentielle Zugabe spezifischer Differenzierungsfaktoren zum Kulturmedium zunächst in getrennten Kulturen gewonnen und charakterisiert werden. Durch Kombination der Kultur- und Differenzierungsbedingungen sollen dann mögliche Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen bei der Differenzierung von hES-Zellen zu Zellen der Netzhaut untersucht werden. Die Eigenschaften sich zu Netzhautzellen differenzierender ES-Zellen sollen auch unter dem Einfluss organotypischer Wechselwirkungen in Ko-Kultur von sich differenzierenden hES-Zellen mit murinen Netzhaut-Explantaten untersucht werden. Nach umfassender Charakterisierung in vitro sollen die Zellen schließlich in Mäuse, insbesondere in Mausmodelle der Netzhautdegeneration, transplantiert und hinsichtlich ihres Überlebens, ihrer Integration in das Wirtsgewebe und ihrer Funktionalität untersucht werden. Die Untersuchungen sollen teils auch unter vergleichender Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden.
An einem solchen Modell könnten weitere Prozesse der
Inhalt des genehmigten Vorhabens ist die Gewinnung von Netzhaut-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen. Dazu sollen zunächst sowohl Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) als auch Zellen der neuralen Retina (Photorezeptor-Zellen) unter Nutzung dreidimensionaler Kultursysteme durch sequentielle Zugabe spezifischer Differenzierungsfaktoren zum Kulturmedium zunächst in getrennten Kulturen gewonnen und charakterisiert werden. Durch Kombination der Kultur- und Differenzierungsbedingungen sollen dann mögliche Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen bei der Differenzierung von hES-Zellen zu Zellen der Netzhaut untersucht werden. Die Eigenschaften sich zu Netzhautzellen differenzierender ES-Zellen sollen auch unter dem Einfluss organotypischer Wechselwirkungen in Ko-Kultur von sich differenzierenden hES-Zellen mit murinen Netzhaut-Explantaten untersucht werden. Nach umfassender Charakterisierung in vitro sollen die Zellen schließlich in Mäuse, insbesondere in Mausmodelle der Netzhautdegeneration, transplantiert und hinsichtlich ihres Überlebens, ihrer Integration in das Wirtsgewebe und ihrer Funktionalität untersucht werden. Die Untersuchungen sollen teils auch unter vergleichender Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt werden.
An einem solchen Modell könnten weitere Prozesse der
Im Forschungsvorhaben sollen zunächst In-vitro-Modelle
ausschließlich humanen Komponenten beruhendes In-vitro-Modell
Im Forschungsvorhaben sollen zunächst In-vitro-Modelle
ausschließlich humanen Komponenten beruhendes In-vitro-Modell
Im Forschungsvorhaben sollen zunächst In-vitro-Modelle
ausschließlich humanen Komponenten beruhendes In-vitro-Modell
